综合以上对梅毒螺旋体抗原的研究,发现tpn15、tpn17、tpn44.5、tpn47的抗原性最强,并且综合抗原的敏感性和特异性比单一抗原更优越
7 centurion la et al.j clin microbiol,1997;35(6):1348-1352
tp抗原的人工合成
ko4 5´-cagagcctcagcccttttca(797-776)
11 young h et al.j clin microbiol,1998;36:913-917
附表:针对编码梅毒螺旋47-kd抗原基因设计的常用引物起莱姆病的
早在19年,issacs等[15]就提出了人工合成梅毒螺旋体抗原进行梅毒血清学诊断的设想同年ijesselmuiden等[16]就合成了tpn44.5(tmpa)用于酶联免疫法检测梅毒,他们检验了938供血者血标梅毒疹痒不痒本,148例未经治疗的梅毒患者,167例已经治疗的梅毒患者,190例性病门诊非梅毒患者,发现该方法特异性为99.6%,对一期梅毒的敏感性为76%、二期梅毒100%、早期潜伏梅毒98%1995年zrein等[17]合成了tpn15和tpn47用于酶免疫法检测梅毒,他们对1822例标本进行检测,发现该方法特异性达99.8%,敏感性接近100%1996年gerber等[18]对梅毒螺旋体抗原进行了较为全面的研究,他们用pcr法扩增了编码梅毒螺旋体抗原的dna,并插入大肠杆菌中使其表达,产生了tpn17、tpn29-35(tpd)、tpn44.5(tmpa)tpn47、tpn35以及tpn39梅毒螺旋体抗原,并应用酶联免疫吸附试验对合成的抗原进行检测,结果发现tpn17、tpn47和tpn44.5的抗体滴度最高,而且这3种抗原联合起来的敏感性要比单一任何隐性梅毒的传播途径一种抗原的敏感性要高,并且与莱姆病螺旋体无交叉反应1997年fujimura等[19]也合成了分子量为17kd、15kd、47kd、42kd的梅毒螺旋体抗原,并用m代表成熟抗原、s代表含有目的序列的抗原、g代表谷胱甘肽-s转移酶融合抗原他们发现m47、s42的表达水平较高,而m15、m17的表达水平很低,但g15、g17的表达水平很高,这使得用层析提纯法能获得大于95%的提纯抗原,他们用elisa法以1∶1000稀释的血清检测这些提纯的抗原(g17、g15、m47、s42)发现g17抗原的敏感性最高同年centurion等[20]对梅毒15kd抗原的研究发现,tpn15的保守性很强,在梅毒螺旋体各株中,如nichol株、bal-3株、gauthier株、bosnia株以及cuniculi a、h、三期梅毒怎么治疗k株,编码15kd抗原的dna序列没有明显变异,并且各株梅毒螺旋体增色表达该抗原,这说明15kd抗原的变异很少
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由于在pcr中会偶然出现非特异的pcr产物而干扰结果,这就必须用特异性的dna探针进行dna-dna杂交来提高pcr的特异性及敏感性此外用tpn47设计的pcr,由于tpn47的保守性,雅司螺旋体可产生类似的pcr产物,所以这种设计的pcr不能区分梅毒和雅司;但可以区分梅毒螺旋体和引博氏疏螺旋体,这就可以解决梅毒与莱姆病之间血清诊断中的免疫交叉问题[6]另一种是rt-pcr,常见的设计是针对梅毒螺旋体的16s rrna 366bp片段[7],这种方法污染少,特异性敏感性高,但价格稍高pcr在梅毒持续感染中的二期梅毒诊断价值目前尚无一致意见,理论上pcr可查出死亡的tp,所以治疗后pcr阳性并不意味着治疗失败,但死亡的tp从机体内清除较快(15～30天),而存活的tp从机体内清除至少需120天,所以治疗数周后pcr阳性意味着持续感染的可能[8]
1 drusin lm.int j std aids,1996;7:7-9
16 ijsselmuiden oe et al.j clin microbiol,19;27:152-157
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19 fujimura k et al.j clin lab anal,1997;6:315-322
目前梅毒检测方法的发展突飞猛进,有针对基层医疗单位的快速、简便的试剂盒,也有针对专门医疗机构,如血站、性病防治机构等每天需要检测大量标本的自动化程度很高的梅毒潜伏期症状试剂盒而国外进口的试剂价格昂贵,为了适应中国国情,必须加强试剂的国产化,以期降低成本这方面有许多工作要做,而低成本合成梅毒螺旋体抗原是关键
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12 young h et al.int j std aids,1998;9:196-200
47-3 5´-ttgtggtagacacggtgggtac 496bp
47-2 3´-acgcacagaaccgattccttg(1284-1305)
合并与并购?
摘要 近年来梅毒的发病率有逐年增加的趋势、研究新的快速、价廉、简便、敏感且特异的诊断方法是当前主要研究热点,而设计新试剂盒的关键在于,对现有试剂盒优、缺点的认识和改良,利用人工合成梅毒螺旋体原设计出新的检测方法对梅毒螺旋体抗原的分析及人工合成,国梅毒螺旋体传播途径外早在19年就已开始进行,几年来发展迅速,目前已有各种针对不同需要的试剂盒
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2004-8-8 16:00:13 国外医学皮肤性病学分册1999年第25卷第5期
17 zrein m et al.j clin microbiol,1995;33:525-527
47-4 3´-tgatcgctgacaagc一期梅毒症状ttaggct(1187-1208)
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梅毒常用诊断方法
3 nakashima ak et al.sex transm dis,1996;23:16-23
ko3a 5´-gaagtttgtcccagttgcggtt(537-559) 261bp
14 sanchez pj et al.j infect dis,1993;167:148-157
目前虽然各国之间梅毒流行的情况送别很大,但它依旧是十分重要的社会和医学问题[1]近年来,大多数欧洲国家梅毒发病率显著下降,已小于2/10万但在前苏家中,梅毒的发病率却显著上升,如俄罗斯梅毒的发病率大于32/10万[2]即使在美国梅毒疹是什么样的,在特定的种族人群中梅毒的发病率依然很高[3]在我国,梅毒的发病率逐年增多,所以研究新的快速、价廉、简便、敏感且特异的诊断方法,对该病的防治有着重要的意义现对目前已有诊断方法的优缺点,以及最新诊断方法作一综述
ice syphilis是基于eia原理设计的试验,由于eia试验自动化程度高、结果客观、能够减少主观操作失误,所以适用于大量标本的筛查ice syphilis的原理是用合成的3种梅毒抗原包被于微孔板上,同时包被在微孔板中的还有抗人igg、igm抗体,并用过氧化物酶标记的合成抗原(tpn15、tpn17、tpn47)检测被捕捉的抗梅毒螺旋体抗体该方法总的敏感性拉近100%,而select syph-g的敏感性为92.4%、t梅毒主要传播途径pha 97.1%、fta-asb 92.4%、vdrl仅为37.5%,此外由于梅毒合并hiv感染的出现,可以使血清中的梅毒抗体水平很低,而ice syphilis的抗体指数(血清吸光值/cut off值)比select syph-g的高(p<0.001),这意味着ice syphilis更敏感,所以虽然原理一样,但ice syphilis用合成抗原要比select syph-g用天然抗原更具优越性,而且99.8%的特异性、对已治疗患者和晚期梅毒患者的高度敏感性,使该方法适用于各种医疗机构
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9 stone dl et al.j clin microbiol,1997;35:217-222
(一)检查梅毒螺旋体:可用病损处的渗出一期梅毒液进行暗视野、涂片银染色、免疫荧光染色、家兔感染试验(rit)或pcr法检测,以及用酶免疫法(eia)理论设计的,利用单克隆抗体检验梅毒螺旋体的方法,如visuwell试验[4]①暗视野显微镜检查由于对取材、检查技术要求较高;并且在口腔及肛门部位有口腔螺旋体、大齿密螺旋体、小齿密螺旋体及生殖器螺旋体等其他条件致病螺旋体存在,暗视野检查时不易与它们区分;此外梅毒螺旋体本身很脆弱,容易受外界条件如服用过抗生素、病损处外用一些化学药物等的影响,该方法敏感性较低,所以暗视野检查阳性也不能排除梅毒的可能性但由于它特异性很高,经过训练的检验人员在暗视野显微镜下看到形态典型的梅毒螺旋体,结合临床症状即可作出早期诊断②梅毒的早期症状女镀银染色法检查螺旋体,适用于缺乏暗神显微镜的基层单位③免疫荧光染色是用抗梅毒螺旋体抗血清或单克隆抗体,加非致病性螺旋体培养物进行吸收,再与异硫氰酸荧光素(fitc)相结合,用此方法来染梅毒螺旋体,在荧光显微镜下读结果,阳性者可见绿色荧光螺旋体,其优点是可区分梅毒螺旋体与其他条件致病性螺旋体,对口腔、肛门等部位的损害有鉴别价值,且敏感性亦有所提高④rit是利用家兔对梅毒螺旋体的易感性,把梅毒螺旋体注射于成年新西兰白兔睾丸内,观察有无感染亦象rit是经典的梅毒诊断方法,由于其费用高、检查时间长等弊病目前仅用于科学研究⑤pcr法是较新的方法,它能对生殖器溃疡早期鉴别诊断,区分梅毒、生殖器疱疹及软下疳[5]梅毒潜伏期能查出来它可分为pcr和rtpcr,pcr的设计主要针对编码梅毒螺旋本特异性抗原和tpn47(tpp47)的dna开放编码区,常见的引物设计见附表
既往设计的酶联免疫试剂盒采用的是梅毒螺旋体nichol株的天然提纯抗原,如select syph-c这种试验的缺点在于天然提纯抗原成分复杂,并且不能非常快速地得到结果,所以用分子克隆技术,人工合成梅毒螺旋体抗原是设计新试剂盒的关键,因为它能克服制备天然抗原时不可避免的兔蛋白污染,并且成分清晰固定,而且可以利用elisa的全自动化、金标纸片法的快速化设计成各种试剂盒
5 orle ka et al.j clin mirobiol,1996;34:49-54
佚名
18 gerber a et al.im三期梅毒munobiol,1996;5:535-549
(二)梅毒血清试验:梅毒螺旋体感染机体后可产生两种抗体,一种是抗心磷脂抗体,即非特异性抗体,亦称反应素,主要方法有性病研究实验室试验(vdri)、血清不需加热的反应素试验(usr)和快速血浆反应素环状卡片试验(rpr)以及capture-s试验——一种非螺旋体抗体因相红细胞吸附试验[9]这种抗体滴度与梅毒活动有关,临床上主要用于观察疗效,复发及再感染另一种是抗梅螺旋体抗体,即特异性抗体,主要有igm和igg检测方法有荧光螺旋抗体吸收试验(fta-abs)及梅毒螺旋体血凝试验(tpha),以及利用螺旋体天然抗体原依照eia原理设计的captia select syph-g试验[10],和新近出现的利用二期梅毒梅毒螺旋体合成抗原(tph15、tpn17、tpn47)设计的ice syphilis eia试验和syphilis fast试验[12]这些方法一般用于梅毒的确认试验,由于检测的是抗梅毒螺旋体igg抗体,所以即使患者经足够的抗梅毒治疗,血清反应仍保持阳性而近年来发展的检测抗梅毒螺旋体igm抗体,却能早期诊断及判断疗效主要方法有:①19s-igm-荧光抗体吸收试验(19s-igm-fta-abs):先用高压液相色谱或其他方法分离标本中的igm,然后再做fta-abs,其特异性与敏感性均很高,但价格昂贵不易推广②igm固相血凝试验(igm-spha)和梅毒螺旋体特异性igm血凝试验(tp-igm-ha)均是对现有方法的改良,要求事先分梅毒潜伏期能查出来离igm抗体③梅毒特异性igm抗体捕捉elisa试验(igm-cap-elisa)[13]:此方法是利用间接elisa的原理,扰抗人igm单抗包被在微量滴定板或其它固相载体上,加入待检血清以捕捉其中的igm,再先后加入超声粉碎或基因重组获得的梅毒螺旋体抗原、生物素标记的抗梅毒螺旋体单抗、辣根过氧化物酶标记的链亲和素及底物,最后通过显色判定结果④sds-page及免疫印迹法:把梅毒螺旋体溶解后的悬液或triton x-114提取液,点于sds-多聚丙烯酰胺凝胶中电泳,电泳后转移至硝酸纤维膜上,分别加入等检血清、辣根过氧化物酶标记的羊抗人igm或igg抗体、底物4-氯萘酚,当出现72、47、45、42、37、17、15kd中的一条或多条显色隐性梅毒的传播途径带即判定为阳性[14]由于梅毒感染后血循环中首先产生的是igm抗体,并且igm抗体不能通过胎盘,而且梅毒患者抗tpigm抗体的出现与梅毒的复发再感染或活动性有关,所以igm抗体检测试验是早期梅毒、胎传梅毒诊断和疗效观察的十分敏感和特异的方法,通过检测抗tp igm抗体可提示是梅毒活动还是静止以及是否需要治疗等
引物名 引物序列 产物
6 jennifer mb et al.j clin microbiol,1991;29:62-69
15 issacs rd et al.seriodiag immunother infect dis,19;3:299-306
英国最大的制药企业葛兰素史克公司(nyse: gsk)完成收购reliant药业公司,收购价为三期梅毒能治好吗16.5亿美元
47-1 5´-gacaatgctcactgaggatagt(648-669) 658bp
1998年young合成了tpn15、tpn17和tpn47,并设计了快速诊断试剂盒syphilis fast[13]和自动化程度很高的ice syphilis[12]试剂盒syphilis fast是将3种合成抗原包被在乳胶颗粒上,当与含有梅毒抗体的血清混合后,可在3分钟内产生肉眼可见的凝集,如果血清中没有抗体,乳胶颗粒将保持均质状如果血清产生凝集则需要做重复试验,重复试验中血清首先与含有合成抗原(与包被抗原一样)的试剂预孵育1分钟,然后加入抗原包被的乳胶颗粒,混合后静置3分钟,如果没有凝集则说明血清中有梅毒抗体存在,而凝集现象被预孵育中的合成抗原抑制了梅毒潜伏期多久;如果产生凝集则说明血清中没有梅毒抗体,第一次试验中的凝集现象不是由梅毒抗体产生的这种试验简单、快速并且敏感性、特异性均很高,用syphilis fast、select syph-g、vdrl、tpha和fta-abs,以平行配对法检测1617例血清标本,结果发现syphilis fast的特异性达99.9%,与select syph-g的特异性99.5%和vdrl的特异性99.4%相比有统计学差异(p<0.02),而syphilis fast 95.6%的敏感性与tpha和fta-abs相比统计学差异syphilis fast和select syph-g对未治疗的梅毒感染的敏感性均很高为96.8%,vdrl对未治疗的早期梅毒感染的敏感性也达92.3%,但对未三期梅毒症状治疗的晚期梅毒感染的敏感性仅为30.8%,而syphilis fast和selcet syph-g对检测已治疗的梅毒,包括晚期梅毒的敏感性也高达95.7%所以该方法可替代rpr、vdrl进行梅毒的初筛,并能克服心磷脂试验中的前带现象
